超级玛丽64DS是有多个游戏模式的游戏，模式分别有VS对战模式、Adventure冒险模式和Rec Room迷你小游戏模式，这个游戏的操作方式也有三种，分别是标准模式、点触模式、双手模式。

“到城堡来，我特意为你烤了一个大蛋糕。”应桃花公主之邀，马力欧与路易吉，瓦力欧来到了蘑菇城堡。但是因为等了很久也不见他们三个出来，耀西决定进城堡一探究竟。进了城堡里面，耀西才发现里面空无一人。

酷霸王偷走了守护城堡的力量之星并把桃花公主关进了墙上的画中。也许，马力欧和他的朋友们也被关进了画中！为了拯救桃花公主和马力欧他们，耀西也跃入了墙上的画中！游戏的操作方法有三种：标准模式、点触模式、双手模式。

VS对战模式：可以支持最大四人单卡无线联机的模式，可以在此与朋友们共享对战冒险之乐。

Adventure冒险模式：游戏最主要的模式，以威力星来定义各关卡及任务，并以取得各关卡的威力星作为目标，在原N64版本的基础上增至150颗，全部15个场景世界的120颗基本关卡威力星和30颗隐藏关卡威力星，另游戏内容更加地丰富。

Rec Room迷你小游戏模式：通过在冒险模式游戏过程中各角色抓到兔子来相继开启的Mini游戏，初期设定为8款，全部共36款游戏，作为在NDS版中独增的模式，其耐玩度和游戏趣味不压于冒险模式的主游戏。

Y键：加速跑，在山坡等地形需要不断地加速冲才可通过。

B键：最直白的跳跃，依照各角色的能力效果各不相同，加速配合跳将能达到更好的效果。

A键：最直接的攻击，对于耀西来说则是用舌头吞吐。

R键：下蹲，虽然单独用的机会不多，但配合跳跃使用的话能衍生其他技能。

下压，B+R键：跳起后在空中按R，最常用的破坏技，用于破坏正下方的物体，效果依照各角色的力量来决定，耀西不具备，瓦里奥的最强。

后空翻，R+B键：先按住R呈下蹲状再跳跃，高度强于普通跳跃。

三段跳，B、B、方向+B键：在第一次跳跃快落地时按跳能使出二段跳，若在此快落地时再配合方向键按B则可使出三倍高度的三段跳。

折返跳：正方向+Y再接着反方向+B。

长跳：方向键+R+B。

踢腿：A+A+A（耀西不能）。

跳踢:B+A（耀西不能）。

拿举物体：A（耀西不能）。

抛掷物体：A（耀西不能）。

爬行前进：R+方向键。

贴墙前进：同时按住面朝着墙的方向和前进方向。

滑行攻击：在加速跑过程中按A（耀西不能）。

滑踢：在加速跑过程中按方向键+R+A。

扫膛腿：按住R的时候再按A。

攀爬：面向杆子按A。

倒立：在杆子顶端按上键。

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